Во експеримент со ориз, истражувачи испитале платформа наречена PrimeStack за внесување големи ДНК-сегменти на однапред избрано место во геномот. Студијата опфатила оризови калусни ткива и регенерирани растенија. Калус е ткиво од растителни клетки употребено во лабораторискиот експеримент. Резултатите покажуваат техничка изводливост во ориз, но сами по себе не докажуваат дека внесените гени ја менуваат хранливата вредност на растението. [c1,c6,c12]
Како функционира платформата?
PrimeStack ги спојува „прецизното уредување“, кое ја препишува генетската информација без двоверижно кинење на ДНК, и ензимот Bxb1. На почетокот, уредувањето создава избрано место за вметнување, наречено attP. Потоа Bxb1 поврзува ДНК-касета со тоа место. Еднонасочната рекомбинација на Bxb1 создава нови спојки што се отпорни на враќање без надворешни фактори. Ова го надминува ограничувањето на самото прецизно уредување, кое трудот го наведува до 200 базни пара и не е доволно за цели гени или патеки. [c3,c4,c5]
Како доказ за пристапот, во калус било насочено вметната касета од 5,3 kb за биосинтеза на каротеноиди; секвенционирањето ја потврдило очекуваната спојка. При тестирање на поголем товар од 9,4 kb, вметнување било откриено во 40–50% од здружените примероци калус. Сепак, не биле добиени регенерирани растенија со таа двојна касета. Геномските „безбедни места“ се однапред дефинирани локуси, односно места во геномот што се сметаат за неутрални и можат да поддржат предвидливо изразување и наследување. [c2,c6,c8]
Што значи забележаната фреквенција?
Кај регенерираните растенија со касетата за каротеноиди, највисоката пријавена фреквенција била 45,3% со варијантата eeBxb1. Оваа бројка е описна: разликите меѓу трите варијанти не биле формално статистички тестирани. Уште поважно, фреквенцијата се темели на PCR-откривање на спојките и покажува дали во примерокот можел да се открие барем еден настан на интеграција. Таа не е непристрасна процена на уделот на интегрирани алели. [c9,c10]
Растенијата немале очигледни морфолошки разлики од контролите пет недели по пренесувањето во почва, но тоа не ја покажува активноста на касетата. Истражувачите не ги измериле ниту изразувањето на внесените гени ниту нивото на каротеноиди. Затоа резултатот покажува дека е можно насочено вметнување повеќегенска ДНК во ориз, а не дека е создаден ориз со докажано зголемена содржина на каротеноиди. За да се проверат и можни случајни вметнувања на други места во геномот, трудот посочува дека е потребно секвенционирање на целиот геном. [c11,c12]
Научна основа и ограничувања
Експериментално истражување на генетско уредување и насочена интеграција на ДНК во оризови калусни ткива и регенерирани растенија.
Испитуван модел: Ориз (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare).
Примерок: 53 регенерирани растенија за eeBxb1; за тестот на 9,4 kb биле анализирани 10 здружени примероци по варијанта, со по 10 парчиња калус во секој примерок..
- Ова е истражување на генетски уреден ориз; не покажува дека платформата веќе функционира кај други култури.
- Фреквенциите се добиени со junction-specific PCR и секвенционирање на Sanger. Самите автори предупредуваат дека овој пристап не ги опфаќа нерекомбинираните алели и не дава непристрасна процена на интеграцијата.
- За eeBxb1 се наведени 53 растенија, а разликите меѓу трите варијанти не биле статистички тестирани; затоа не може да се заклучи дека една варијанта е подобра.
- Испитувањето на товарот од 9,4 kb било во калус и вклучувало здружени примероци; растенија со двојната касета не биле регенерирани.
- Не биле измерени изразувањето на касетата и нивото на каротеноиди. Морфолошките набљудувања во вегетативна фаза не ја утврдуваат нејзината функција.
- Трудот наведува дека секвенционирањето на цел геном е потребно за да се провери дали има дополнителни случајни вметнувања на друго место во геномот.
